ESPECTROFOTOMETRÍA

BIOLOGÍA Y GEOLOGÍA UNIVERSIDAD

PROCESO

 

1. Tratamiento de previo de las muestras problema (Practica anterior):

  • Medir el volumen total de dializado que se obtuvo
  • Preparar tres (3) diluciones de la muestra que se ha mantenido en diálisis por una semana
    a. 1:25
    b. 1:50
    c. 1:75
  • De cada dilución se trasvasan 0,1 mL, por duplicado, en tubos de ensayo. Luego, se agregan a todos los tubos 0,3 mL de agua destilada y 0,8 mL de NaOH y se agita un poco en el vortex.

2. Elaboración de la curva de calibración. Se sigue la siguiente tabla:

 

μL BSA 0 25 50 75
μLNaOH 700 675 650 625
μL H2O 300 300 300 300

3.Método Lowry.

Los siguientes pasos deber ser realizados tanto sobre las diluciones de las muestras problemas como sobre la curva patrón.

  • Preparar una mezcla de los reactivos c y d, en una relación 50:1 y agregar a cada tubo 2 mL, agitar.
  • Después de 10 min, agregar 0,4 mL del reactivo e, y agitar inmediatamente.
  • Dejar en reposo por 30 min a temperatura ambiente y leer en espectrofotómetro a 750 nm.
Muestra

Abs (750 nm)

Abs (480 nm)

Patrón 25 _____________ _____________
Patrón 50 _____________  _____________ 
Patrón 75 _____________  _____________ 
Muestra 1:25 _____________  _____________ 
Muestra 1:50 _____________  _____________ 
Muestra 1:75 _____________  _____________ 

 

Para la curva de calibración

  • Calcular y apuntar la cantidad de μg de albúmina en cada tubo
  • Indicar la absorbancia observada para cada solución
  • Promediar los valores duplicados correspondientes a cada tubo del patrón.
  • Graficar absorbancia vs concentración y ajustar dicha curva de calibración a una curva de primer orden (y= mx + b)

Para mayor informacion sobre como realizar una curva de calibración con los datos obtenidos, ver video: https://www.youtube.com/watch?v=Bi4wmnfGv1M

Para las muestras problema

Con ayuda de los datos obtenidos de la curva patrón determinar la concentración de albumina en la muestra original de 10 mL de clara de huevo con el cual se inició la practica la semana anterior. No olvide tomar en cuenta las diluciones realizadas durante esta sesión práctica.

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