ESPECTROFOTOMETRÍA

BIOLOGÍA Y GEOLOGÍA UNIVERSIDAD

INTRODUCCIÓN

 

Existen diferentes métodos para cuantificar la concentración de proteínas, las cuales presentan algunas características básicas comunes. Sin embargo, varían en la composición de aminoácidos, secuencia, en tamaño, forma y estructura.



El método Kjeldahl constituye una técnica para determinar la concentración de proteínas. Pero, existen las técnicas espectrofotométricas, tales como las de Lowry (1951) o Bradford (1976). A pesar de que el método de Lowry es muy utilizado, no da totalmente una curva de calibración lineal, la cual se realiza generalmente utilizando Albúmina de Suero bovino. La coloración dada por cada proteína en el método de Lowry, depende del contenido de tirosina y triptófano. Así, la variación de respuesta con varias proteínas puede ser significativa. Además, hay que tomar en cuenta que algunas sustancias interfieren con la cuantificación de proteínas, cuando se utiliza el método de Lowry.

 

En el método Bradford, la proteína es pigmentada por el colorante CoomassieBrilliant Blue. Este se basa en el cambio del máximo de absorción del colorante de 465 a 595, el cual ocurre cuando el colorante reacción con la proteína. En la presente práctica, se hace reaccionar a una solución de proteína con varios reactivos para que produzcan soluciones coloreadas. Las determinaciones se realizan, bajo condiciones que aseguran que la intensidad del color desarrollado en cada solución sea proporcional a la concentración de la proteína, en cumplimiento de la Ley de Lambert y Beer.

 

La intensidad del color se mide con ayuda de un espectrofotómetro y se expresa en Absorbancia. Para ello, en esta práctica se emplea el método de Lowry y colaboradores, el cual está basado en: a) la reacción del ión Cu+2 con las proteínas, que conduce a la formación de un complejo cobre-proteína, en un medio alcalino y b) a reducción del ácido fosfomolibdotúngstico (reactivo de Folin-Ciocalteu) por el complejo cobre-proteína, dando como resultado la aparición de una coloración azul. La intensidad del color se determina por su absorbancia a 580 nm.

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